ROS活性氧檢測技術
 ROS活性氧檢測技術利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧的檢測。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。

ROS活性氧檢測技術

步驟

1.裝載探針

1.1 原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

① 細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，檢測時細胞匯合度達到50~70%。

【注】：細胞狀態健康，且檢測時不會過度生長。

② 藥物誘導：去除細胞培養液，加入適量經合適的緩沖液或無血清培養基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間根據藥物本身特性，以及細胞類型來決定。

（可選）陽性對照：先用無血清培養基等稀釋陽性對照（Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細胞，一般37℃避光孵育30min-4h可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異?！救?，HeLa細胞孵育30min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5h；】

③ 探針準備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

④ 探針裝載：吸除誘導用藥物，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜。如，對于6孔板通常不少于1000μl，對于96孔板通常不少于100μl。37℃細胞培養箱內避光孵育30 min。

⑤ 細胞清洗：用無血清培養液洗滌細胞1~2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

1.2 收集細胞后裝載探針：適用于貼壁細胞和懸浮細胞。

① 細胞準備：按照標準方法培養細胞，檢測用細胞狀態健康。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。

② 藥物誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間根據藥物本身特性，以及細胞類型來決定。

（可選）陽性對照：先用無血清培養基等稀釋陽性對照（Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細胞，一般37℃避光孵育30min-4h可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異?！救?，HeLa細胞孵育30min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5h；】

③ 探針準備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

④ 探針裝載：去除細胞內藥物，離心收集細胞，加入適當稀釋好的探針，使其細胞密度為1.0×10⁶~2.0×10⁷?！?strong>注】：細胞密度需根據后續的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調整。如，對于流式分析，單管檢測內細胞數目不少于10⁴，也不可多于10⁶。每隔3-5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。

⑤ 細胞清洗：用無血清細胞培養液洗滌細胞1~2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

2.檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3.參數設置

使用488nm激發波長，525nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數設置檢測DCF。

ROS活性氧檢測技術

注意事項

1） 探針裝載后，要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

2） 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。

3） 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

4） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

目前，上海劍鈍生物科技有限公司主營實驗技術服務，動物模型構建，服務，試劑盒，細胞株等，歡迎廣大科研者前來購買！