Western blot，內參蛋白選用技巧！

一、Western Blot實驗為什么要用內參?

Western Blot實驗結果進行內參校正已成為一種慣例。目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的組織細胞蛋白上樣，才有比較的基礎，特別是表達量不高時，上樣量的的差別就很有可能影響結果的分析。因此，在Western Blot試驗中，進行內參的檢測，有以下兩點作用：

1、校正蛋白質定量、上樣過程中存在的誤差，實驗結果的準確性；

2、使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否、整個Western Blot顯色發光體系是否正常。

二、你的內參選對了嗎？

作為內參的蛋白要符合的標準，可從以下幾方面入手：

1、先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。

2、內參的檢測帶與那些目標蛋白的檢測帶在分子量上有所不同；

選擇內參抗體時，應該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應該目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD，此時不適宜選擇β-actin作為內參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內參。

針對不同樣品制備常用的內參以及它們的分子量

3、要考慮目的蛋白表達部位

就一般的蛋白檢測來說，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當的核蛋白內參則更能體現內部參照的價值。常用的核內參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見的核蛋白內參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻報道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測，常用的內參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內參抗體。

4、實際的實驗環境

有些細胞在某些條件下內參表達會出現異常，使其不適合做內參。

①某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內參。

②在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內參。

③在加入抗癌和抗真菌藥物時，Tubulin的表達易受影響，不適合作為內參。

④Lamin B不適合作為胚胎干細胞的內參，而PCNA不適合作為非增殖細胞的內參等。其他具體可查詢相應文獻。

5、不同的組織特異性

actin 即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參。

三、實驗中使用內參的方法你知多少？

在Western Blotting實驗過程中使用內參的方法通常有以下三種。

1、超級簡便的標記內參使用法，只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可；

2、普通內參，當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

3、當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開，然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。